在神經系統中，一氧化氮（NO）過量可以產生亞硝化應激反應，導致神經退行性損傷【1】。在阿爾茨海默病（AD）, β-淀粉樣肽（Aβ）的低聚化、過度神經興奮、神經炎癥等都會導致NO的產生，繼而發生S-亞硝基化【2】。
S-亞硝基化（S-nitrosylation，簡稱SNO）是一種快速可逆和精確定向的翻譯后修飾，指NO陽離子（NO+）共價結合到半胱氨酸殘基巰基（S-）上。SNO是系統發育中細胞信號傳遞的基本機制【3】。 發動蛋白相關蛋白1（Drp1）是一種鳥苷三磷酸酶（GTPase），Drp1的S-亞硝基化會導致Drp1的過度激活，繼而導致線粒體的破碎和生物能量的不足，再進而導致突觸丟失，而突觸數量減少與AD認知能力下降密切相關【4-5】。因此這種S-亞硝基化反應可能參與了該AD的發病機制。 已被S-亞硝基化的周期蛋白依賴性激酶5（Cdk5）通過去亞硝基化反應將NO傳遞給Drp1，形成亞硝基化的Drp1【6】。然而，這種病理性的一系列連續反應、及反應參與者還有待確定。這一問題的正確回答，將有助于我們進一步理解AD的發病機制，以及研發潛在的AD治療藥物。 美國斯克利普斯研究所（the Scripps Research Institute）的Stuart A. Lipton教授實驗室長期從事于通過研究分子信號通路來阻止突觸損傷，以及正常衰老和各種神經退行性疾病中的神經元損傷。在于2020年12月3日以Noncanonical transnitrosylation network contributes to synapse loss in Alzheimer’s disease為題發表在Science上的新研究文章中，該實驗室通過研究AD的體外和體內模型、以及人類AD死后大腦組織揭示了具有不同生化途徑的不同催化活性的酶可以形成一種S-亞硝基化級聯反應，導致AD突觸損失：NO基團從去泛素化酶Uch-L1轉移到Cdk5，然后再轉移到Drp1。此研究提示一系列異常的亞硝基化途徑和去亞硝基化途徑在神經退行性疾病的病理生理中可能伴有重要角色。

Uch-L1，全稱泛素羧基末端水解酶L1，是一種去泛素化酶，水解泛素羧基末端加合成分，產生泛素單體【7】。為了方便，UCH-L1的S-亞硝基化，或S-亞硝基化的Uch-L1，統簡稱為SNO-Uch-L1。生物素轉換方法（biotin-switch assay）是一種可以用來直接檢測細胞或組織中蛋白質巰基亞硝基化（S-Nitrosylation）的生物素標記方法【5,8】。首先作者通過生物素轉換方法在SH-SY5Y和HEK細胞模型證實了SNO-Uch-L1的存在，在AD小鼠中，SNO-Uch-L1的水平明顯上升。質譜結果顯示Uch-L1的第152位點半胱氨酸的點突變（簡稱C152S）則會顯著減弱這種S-亞硝基化。而且在Tg2576和hAPP-J20兩種AD小鼠、以及AD人腦組織中，SNO-Uch-L1導致Uch-L1酶活性降低，而過表達Uch-L1則會改善突觸功能和記憶性能。這些結果提示了Uch-L1活性在AD發病機制中的重要性。

圖1 Aβ低聚物誘導SNO-Uch-L1的形成，進而引起突觸的缺失
（T. Nakamura et al., Science 2020; aaw0843）

緊接著，作者注意到，在大鼠原代皮層神經元中，過表達Aβ1-42低聚物會有SNO-Uch-L1的形成和突觸的丟失（圖1A-C）。那么，問題來了，突觸的丟失是由Aβ1-42低聚物所引起，還是由SNO-Uch-L1所引起，亦或是由兩者共同所致？在過表達Aβ低聚物的AD小鼠的齒狀回中注射Uch-L1，免疫組化結果證實SNO-Uch-L1會導致突觸的殘缺（圖1D-E）。這也暗示了人類AD中突觸丟失與認知能力下降有密切的神經病理學關系。

圖2  NO基團的連續轉移反應: 從Uch-L1轉移到Cdk5（SNOC為亞硝基半胱氨酸，提供NO基團）

（T. Nakamura et al., Science 2020; aaw0843）

那么，在Uch-L1、Cdk5和Drp1三者之間，NO的轉移有什么順序關系？或從誰到誰再到誰（圖2A）？之前有研究顯示NO可以從SNO-Cdk5轉移到Drp1，但是Cdk5上游的NO轉移機制，特別是由Aβ介導的SNO機制，我們并不清楚。通過免疫印跡、生物素轉變方法、SNO蛋白形成相對速率比較等一系列實驗，作者觀察到：在HEK細胞模型細胞模型內敲低Uch-L1則會明顯觀察到Cdk5和Drp1、以及SNO-Cdk5和SNO-Drp1的先（10分鐘）后（25分鐘）下降（圖2-3）；而在神經元細胞模型SH-SY5Y中，相比較野生型Uch-L1，表達突變體Uch-L1，即C152S（前文結果可知其可顯著抑制Uch-L1的SNO）后，SNO-Cdk5和SNO-Drp1明顯較少（圖3A-E）。這些結果說明了NO轉移順序或SNO先后順序，即從Uch-L1到Cdk5再到Drp1。

圖3 NO基團的連續轉移反應: 從Uch-L1到Cdk5再到Drp1

（T. Nakamura et al., Science 2020; aaw0843）

能斯特方程（Nernst equation）是指用以定量描述某種離子在兩種不同體系間形成的擴散電位的方程表達式【6,9】。在電化學中，能斯特方程用來計算電極上相對于標準電勢而言的指定氧化還原對的平衡電壓【6,9】。簡言之，能斯特方程能夠表征離子濃度改變時電極電勢的變化。因此作者設計了一種能斯特方程，定量分析了S-亞硝基化反應（SNO）的熱力學特征。結果也再一次肯定了上述關于NO基團連續轉移的結論。 這些研究結果與人類AD的神經病理生理學的相關性如何？因此，文章，研究人員應用AD患者死后腦組織進行了分析，發現：在AD疾病晚期SNO-UchL1的量顯著增加，而對照組SNO-Uch-L1的量極低（圖4A-B），這與Uch-L1的S-亞硝基化反應只有在疾病狀態下的出現異常的先前觀點是一致的；而且SNO-Uch-L1與總UchL1的比值明顯增加，突觸缺失也更為嚴重（圖4A-B），這表明了在人AD腦內中SNO-Uch-L1的異常增加，具有（或表現出）突觸病理生理意義（或特征），可能會加重AD。此外AD小鼠明顯中也有這些類似現象（圖4B）。

圖4 AD患者大腦和小鼠中Uch-L1的SNO及比較，以及S-亞硝基化（NO轉移）模型

（T. Nakamura et al., Science 2020; aaw0843）

結論與討論、觀點與展望

總的來說，首先，這項研究表明，盡管Aβ具有神經毒性，然而去泛素化酶Uch-L1的S-亞硝基化也具有神經毒性，表現為突觸損傷，而Uch-L1突變體（C152S）則具有神經保護作用。

其次，作者證實了NO的連續轉移反應：首先Aβ誘導產生NO，并與Uch-L1發生S-亞硝基化反應，形成SNO-Uch-L1；然后SNO-Cdk5發生S-去亞硝基化反應，產生新NO基團，并轉移到Cdk5上，形成SNO-Cdk5；同理，NO基團從SNO-Cdk5轉移到Drp1，形成SNO-Drp1（圖4C）。這一級聯反應可能影響AD的進展。 研究也提示我們，揭示泛素水解酶、激酶和GTPase等酶在AD等疾病條件下的亞硝基化反應機制可能是理解這些疾病病理過程的一類新思維，靶向這些酶的亞硝基化活性或去亞硝基化活可能是AD的治療靶點。 ，仔細看來，這篇文章的證據并不那么強有力，且還有很多未解之謎，但是研究者所提出的“非經典亞硝基化反應網絡”、“去亞硝基化反應網絡”，或許為我們將來理解神經退行性疾病（包括AD等）的復雜病理過程開辟了新思維、新方向。這種不同酶之間的亞硝基化級聯反應，與經典的AD病理假設（Aβ，tau）、或其他非經典AD病理假設之間的邏輯關系如何？答案未知。